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如何蛋白質純化.....請往下看



Ⅰ.目的

　　表現目標基因得到萃取的蛋白質，可以進行各種純化方法，例如硫酸銨沈澱、膠體過濾法、離子交換法、親和層析法等，以分離目標蛋白質，同時檢定其基本生化特質，例如定量分析、酵素活性分析、膠體電泳、西方雜合分析等。

　　在分子生物學上，要仔細研究一種蛋白質的結構與功能（structure and function），必須把此蛋白質純化出來。基本上，可利用蛋白質的一些特性，將其從細胞內無數的蛋白中分離出來。純化的方法一般是利用其溶解特性、色層分析特性和分子量來設計的。當這些方法都無效時，可採用更精細的方法。純化過程的每個階段，都必須測試酵素的專一活性，即每毫克蛋白質中酵素的活性，它顯示出酵素的純度。

　　本實驗的設計是大量培養轉形細胞株pCRT7/CT-LacZ〔BL21（DE3）〕並收集起來，參照實驗15來製備蛋白質，以離心去除細胞殘渣，在上清液中加入硫酸銨（ammonium sulfate）將大部份的b-gal沈澱下來，此時的純度已提高了2~5倍。將沈澱物溶於緩衝液中，把硫酸銨透析(dialysis)出來，再經膠體過濾管柱（gel filtration column）逕行純化蛋白質，最後以SDS-PAGE電泳測定蛋白質的純度。[註：超出課程之外的純化方式相當多，包括超過濾（ultrafiltration）、色層分析法（chromatography）例如離子交換（ion exchange)、親和性（affinity)和高表現度的液相色層分析（HPLC）等。]

　

II.硫酸銨分餾（ammonium sulfate fractionation）

1.在細胞萃取液中，目標蛋白質通常只佔總蛋白質<1%的量。在此情況下，通常會先利用溶解度之不同，從很多種蛋白質中把目標蛋白質分離出來。以溶解度來區分之步驟可有效地去除大量雜質，例如熱處理、選擇性沈澱法（在pH = pI時）、有機溶媒沈澱法（polyethylene glycol）和鹽分餾（salt fractionation）等，都是利用溶解度來分離的技術。其中，以硫酸銨做鹽分餾為最普遍。硫酸銨易溶於水，純度高，又經濟，還可以把蛋白質穩定下來。當離子強度弱時，加入硫酸銨就會有促進蛋白質溶解的salting-in效應。但當加入更多硫酸銨後，蛋白質的水溶性下降，會salting-out而沈澱下來，造成各種蛋白質沈澱下來的硫酸銨濃度就是該種蛋白質的特性，其特性會隨著pH、溫度和蛋白質濃度而改變。藉硫酸銨沈澱的蛋白質通常還保有其原本的異構相，可以再被溶解，並以沈澱之型態保存起來。

2.儀器用具：

a. 冷凍離心機

b. 冰浴

c. columns

d. 磁性攪拌器

3.藥品及試劑：

a. 硫酸銨（ammonium sulfate，(NH4)2SO4）

b. 透析膜（dialysis）

c. Z buffer（參見實驗14）

d. PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）

e. NaOH

4.方法步驟：

１）已誘導表現b-gal的細胞萃取物（參見實驗15）加入Z buffer稀釋至100 ml，置於磁性攪拌平台上，(加入PMSF使其最終濃度為1 mM)。

２）慢慢加入固體硫酸銨（17.6 g），使其最終濃度為30%，繼續攪拌10分鐘。

３）在4℃下，以12,000 rpm離心10分鐘。

４）倒去上清液，將沈澱物以Z buffer溶解之（約等倍體積）。（不溶解的物質大概是特殊的或變性的蛋白質）

５）在4℃下，以12,000 rpm離心5分鐘，保留上清液。(註：半乳糖??在30%硫酸銨中，幾乎全部沈澱下來，反而在此濃度下，只有25%全部細胞蛋白質會被沈澱，故選擇30%硫酸銨濃度最有利於純化半乳糖??。)

　

III.凝膠過濾色層分析法（gel filtration column）

1.凝膠過濾色層分析法，又稱為尺寸排斥色層分析法（size exclusion chromato-graphy），它會藉著分子在水中的體積而阻止其流動，要將分子分開，就要依所採用的凝膠過濾基質及分子的水和體積（hydrodynamic volume）而定。此法常用的一種材料是商業名稱為Sephadex的分子篩（一種改良過的dextran），經交聯後會有親水性及立體的網路，較鬆散的凝膠用來分離分子量大的物質，較緊密的凝膠則分離分子量小的化合物。此法的普通用途有去鹽作用、濃縮分子量高物質、交換緩衝液、去除有機物、測定蛋白質分子量、去除低分子量或放射性標記的化合物、終止反應及去除酵素的產物或抑制物等。

2.儀器用具：

a. 管柱（column, 2.5 ’ 50 cm, 可容納250 ml）

b. 分段收集器（fraction collector）

c. UV monitor或spectrophotometer

d. 流量調節閥

3.藥品及試劑：

a. Sephadex G-200

b. Z緩衝液（參見實驗14）

4.方法步驟：

１）將6g Sephadex G-200懸浮於500 ml的Z緩衝液，以玻棒攪拌置於沸水浴中30分鐘，在室溫下冷卻。

２）倒掉液面60%上清液，架好管柱後，關閉下方排水軟管，加入50 ml Z緩衝液到管柱中（注意！務必做排氣），再把Sephadex倒入。

３）調整流速（<1ml/min），packing column。（若長期貯藏管柱，可在緩衝液中加入0.02% NaN3，以避免微生物污染）

４）調整流速，將上述硫酸銨沈澱出的上清液加入管柱中，以適當體積收集流出物。（註：可以blue dextran 平均分子量為2,000,000來估算廢棄物的體積）

５）若有UV monitor可定OD280讀取樣品流出與否，若無，則用UV spectro-photometer 讀取各管之OD280，並畫出沖離液之曲線圖。

６）利用實驗14測定半乳糖??存在於那個波峰沖離液中含量最高。

　

IV.親和層析法（His-Bind column chromatography）

1.若表現蛋白質上含有一段六個Histidines的片段，而親和膠體上接有鎳離子(Ni2+)，則此蛋白質會專一性地結合到親和膠體，待洗去雜質後，即可用imidazole洗下純化之蛋白質。

2.儀器用具：

a. 管柱（column, 2.5 ’ 50 cm, 可容納250 ml）

b. 分段收集器（fraction collector）

c. UV monitor或spectrophotometer

d. 流量調節閥

3.藥品及試劑：

a. Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia 17-0575-01): 1 ml

b. 8X charge buffer (400 mM NiSO4)

c. 8X binding buffer (40 mM imidazole, 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9)

d. 8X wash buffer (480 mM imidazole, 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, pH 7.9)

e. 4X elute buffer (4 M imidazole, 2 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9)

4.方法步驟：

１）將管柱架直在鐵架上，把1 ml親和膠體懸浮裝填於管柱內，用3 ml水流洗。

２）用5 ml 1X charge buffer流洗。

３）注入蛋白質樣本，用10 ml 1X binding buffer流洗。

４）用6 ml 1X wash buffer流洗。

５）用3 ml 1X elute buffer流洗，並收集流出液，若有UV monitor可定OD280讀取樣品流出與否，若無，則用UV spectrophotometer 讀取各管之OD280，並畫出沖離液之曲線圖。

６）利用實驗14測定半乳糖??存在於那個波峰沖離液中含量最高。

　

V.蛋白質的濃縮

1.各種大小不同的蛋白質分子進入凝膠過濾色層分析後，可依其分子量的差異分離開來，收集到的樣品雖然純度高但往往體積變成很龐大，下一步即是如何濃縮純化到的蛋白質。本實驗採Centriprep系列方式，乃利用離心力壓擠小分子濾過超微薄膜，是一種超微過濾法（ultrafiltration）。市售Centriprep-50可過濾50 KDa以下的蛋白質分子，可把水濾掉，實兼具純化與濃縮之效。

2.儀器用具：

a. 離心機

3.藥品及試劑：

a. Centriprep-50（Amicon, Millipore）

4.方法步驟：

１）收集b-gal活性區，放入透析膜內在10 mM Tris-HCl, pH7.0之中透析（dialysis）過夜或一小時，轉移至Centriprep-50管中。

２）在4 ℃下，慢速5,000 rpm離心30分鐘數次直至濃縮到數ml。

３）以SDS-PAGE即酵素活性分析來鑑定各階段純化的情形，包括粗萃取液、硫酸銨沈澱、凝膠過濾色層分析及濃縮後等的半乳糖??純度





Ⅰ.目的

　　本實驗採用不連續膠體電泳方法（SDS-PAGE），偵測目標蛋白質之位置。電泳的高解析力使其成為分子生物中有效的分析利器，不連續膠體電泳（disc-PAGE）是以原態蛋白質進行電泳，一般用做純度檢定或活性分析，SDS-PAGE則用次體分子量之測定，梯度（gradient）電泳則可輔助原態蛋白質分子量之決定。結合了SDS及梯度兩種特性的SDS-gradient PAGE，其解析力最高。

　　電泳形式由早期使用圓柱狀膠體，演變成直立式的平板膠片（16’18 cm），最後改成迷你電泳膠片（8’10 cm），電泳時間只約二小時，而其解析力不變。目前柱狀膠體電泳，只用在等電焦集法，以進行二次元電泳；而大型平板電泳則多用在製備式電泳，故一般電泳大多以迷你膠片進行之。膠體材質的種類亦多，但用在蛋白質者則以聚丙烯醯胺為主。在泳動率上，蛋白質的泳動率與其分子量成反比。

II.蛋白質電泳分析

1.儀器用具：

a. 迷你蛋白質電泳槽

b. 蛋白質鑄膠器

(1)玻璃板（8’10 cm） 1片

(2)白色氧化鋁片 1片

(3)spacer間隔條（0.75 mm） 2條

(4)Comb樣本槽齒模（0.75 mm） 1隻

c. 電源供電器

d. 塑膠染色盒

e. 搖盪器（shaker）

f. 看片箱（light box)

g. 膠片乾燥組合

(1)塑膠框

(2)玻璃紙（cellophane年糕紙）

h. 護貝機及護貝膜

i. 乾浴器

2.藥品及試劑：

a. A液: 丙烯醯胺液（total 30%, cross-linking 2.6%）29.2 g acrylamide + 0.8 g Bis，加水至100 ml（注意！acrylamide具神經毒！不要直接接觸，凝膠後毒性消失）

b. B液: 分離膠體緩衝液（running或separation buffer）90.8 g Tris base + 108 ml TEMED，加水300 ml，以1 M HCl調pH 8.8，再加水至500 ml。（註：tetramethylenediamine可幫助自由基的傳導，是一種催化劑）

c. C液: 焦集電泳緩衝液（stacking buffer）6 g Tris base + 0.4 ml TEMED，加水40 ml，亦以1 M HCl調pH 6.8，再加水至100 ml。

d. D液：電泳緩衝液（chamber buffer）5 x 30.3 g Tris base + 142.6 g glycine（甘氨酸），加水800 ml，pH調至8.3，再加水至1 L，使用時稀釋5倍。[註：glycine是電極緩衝液的主要因子，是造成電泳樣本焦集的原因，可改用boric acid（如下面F液）]

e. E液: 樣品溶液2 X: 3 g Tris base + 14.8 mg EDTA + 4 g SDS + 10 ml 2-mercaptoethanol，加水80 ml，pH調至6.8，再加水至100 ml。

f. F液: 通用電泳緩衝液5 x: 54.5 g Tris base + 24.8 g boric acid + 4.7 g EDTA，加水800 ml，pH調至8.4，再加水至1 L。

g. 10% SDS（注意：SDS粉末很輕，飛揚起來很容易吸入肺部，在肺泡溶解產生界面活性的作用，使得肺部細胞無法進行氧分子交換，秤取時務必戴口罩）

h. 5% APS: 過硫酸銨（ammonium persulfate是自由基free radical的產生者，可誘發acrylamide的連鎖聚合反應，是整個凝膠反應的起始者。最好使用前才配製，冬天可增至10%，夏天可減至2%，注意APS固體很容易分解，應密蓋存於乾燥皿，一般鑄膠無法凝固的原因多出自於此）

i. 追蹤染劑（tracking dye）1 mg bromophenol blue加5 ml水，再加5 ml甘油，混合均勻。

j. 染色液（CBR）1.5 g Coomassie brilliant blue R-250加水250 ml，再加250 ml甲醇及50 ml醋酸，混合均勻，若有不溶物質則需過濾。前面蛋白質定量用的CBG（Coomassie brilliant blue G-250）染色效果稍差。

k. 脫色液（7%甲醇及7%醋酸）在1 L量筒中，置入70 ml methanol + 70 ml acetic acid，再加水至1 L，混合均勻密蓋。甲醇可提高到20%，可增加脫色速度，但小心脫色過度。

l.蛋白質標準分子量：一般常用的有Myosin (250 KDa), phosphorylase (94 KDa), albumin (67 KDa), glutamic dehydrogenase (64 KDa), alcohol dehydrogenase (50 KDa), ovalbumin (43 KDa), carbonic anhydroase (36 KDa), myoglobin (30 KDa), trypsin inhibitor (20 KDa), lysozyme (16 KDa), lactalbumin (14.4 KDa), aprotinin (6 KDa), insulin B chain (4 KDa)。

3.方法步驟：

１）整理一組鑄膠器，以酒精拭淨，三明治組合後直立站好，準備SDS膠體溶液依序如下表，0.75 mm厚的平板膠片約需20 ml分離膠體溶液與5 ml焦集膠體溶液（體積為ml）：

分離膠體(10%) 焦集膠體(4%)
A液(30%) 6.70 0.66
B液 5.00 —
C液 — 1.24
10% SDS 0.20 0.05
H2O 8.00 2.95
APS 0.10 0.10
Total 20.00 5.00

２）分離膠體各成分在小燒杯中混合均勻後，倒入鑄膠組合到8成高，勿陷住氣泡，再輕輕小心加上一層水層，靜置30分鐘。

３）倒去水層，加入焦集膠體溶液到滿，並插入樣品槽齒模，靜置30分鐘。

４）取下齒模即可進行電泳，若不立刻用，可把整個膠片組合用保鮮膜包好，膠面上方加一水層，勿使乾掉，在4 ℃約可保存一週。

５）架膠片組合到電泳槽，取F液稀釋成1 x並加SDS成為0.1%，加於正負極槽內，以微量吸管清洗齒槽內殘留的膠體。

６）取蛋白質樣本溶液（來自實驗15），加入同體積E液及適量之追蹤染劑bromophenol blue，混勻後在100 ℃加熱10分鐘，放冷後注入樣本槽，並注入蛋白質標準溶液以為對照，以100~150V進行電泳。

７）待追蹤染料泳動到底邊，中止電泳，取出膠片進行CBR染色約30分鐘。（註：若要進行蛋白質轉印（西方雜合分析），則膠片不能染色）

８）回收染劑，水沖洗藍色膠片，再倒入20 ml脫色液，如此脫色數次，在1小時內應可見蛋白質色帶的出現。

９）待膠片背景完全透明後，倒去脫色液，改用50%甲醇洗一兩次，待膠片縮至原尺寸，即可乾燥之。

10）用水浸濕cellophane並平鋪，放上膠片後再加一層濕的cellophane，趕去氣泡，用紙巾吸乾水份，用電扇或冷氣可加快乾片速度，靜置過夜。

11）待膠片完全乾燥後，剪去多餘的cellophane，再加護貝永久保存。